仿生消化法評(píng)定豬飼料生物學(xué)效價(jià)的優(yōu)點(diǎn)與研究進(jìn)展
2014-1-10 飼料人才網(wǎng)
飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)評(píng)定的宗旨是為了揭示飼料被畜禽采食后消化、吸收，經(jīng)過動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入相應(yīng)的組織器官，再轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品的過程。在表達(dá)消化、代謝、轉(zhuǎn)化的過程及其涵義方面，前人曾提出種種倡議。Fox將“生物學(xué)效價(jià)”定義為“飼料中某種養(yǎng)分支持生物機(jī)體結(jié)構(gòu)與機(jī)能正常的量化估測(cè)”；Sibbald(1987)認(rèn)為“生物學(xué)效價(jià)”是一種抽象的概念，是養(yǎng)分進(jìn)入體組織后用于正常代謝機(jī)能的效益；Ammerman將“生物學(xué)效價(jià)”定義為：動(dòng)物食入營(yíng)養(yǎng)素中能被小腸吸收并參與代謝過程或貯存在動(dòng)物組織中的部分占食入總量的比值；許振英將生物學(xué)效價(jià)剖分為“絕對(duì)生物學(xué)效價(jià)”與“相對(duì)生物學(xué)效價(jià)”兩類概念；張子儀認(rèn)為“飼料生物學(xué)效價(jià)”應(yīng)包括消化率(digestibility)、吸收率(absorbability)、代謝率(metabolizability)、同化(assimilation)、有效性(utilization)、可利用率(availability)乃至飼料組合效應(yīng)(associ ative effect of feeds)等多重涵義。
在生物學(xué)效價(jià)的評(píng)定手段上，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家們?cè)谙�、代謝能和凈能的測(cè)試手段、立論依據(jù)、數(shù)學(xué)模型等方面進(jìn)行過大量的研究。最早可溯及法國(guó)化學(xué)家拉瓦錫(Lavaisier Antoine Laurent，1743～1794)創(chuàng)建的小型動(dòng)物呼吸代謝熱量測(cè)定裝置，他首次否定了“燃素說”，命名氧元素為“oxygen”，闡明了燃燒作用的氧化學(xué)說，再一次證實(shí)了“質(zhì)量守恒定律”。經(jīng)過近兩個(gè)多世紀(jì)的科研實(shí)踐，迄今消化能和代謝能測(cè)值仍然是“凈能體系”賴以成立的關(guān)鍵性決策依據(jù)。但是經(jīng)過實(shí)踐，許多學(xué)者從不同角度對(duì)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中的有效能值采用凈能體系提出質(zhì)疑，如Wiseman和Cole認(rèn)為凈能值太敏感不適宜實(shí)際應(yīng)用；美國(guó)NRC的專家們認(rèn)為凈能的測(cè)定太困難、不精確和受影響的因素太多；Emmans總結(jié)指出：能量用于維持和脂肪沉積、蛋白沉積的效率是不一樣的，因此不能用“凈能”來簡(jiǎn)單描述；Whittemore認(rèn)為凈能指標(biāo)并不比消化能、代謝能指標(biāo)為優(yōu)化飼料配方或預(yù)測(cè)生產(chǎn)成績(jī)提供更為精確的信息。因此，當(dāng)前對(duì)飼料能量生物學(xué)效價(jià)評(píng)定的一個(gè)共識(shí)仍然是像Fuller指出的那樣：“一個(gè)體系越是追求生產(chǎn)過程中的實(shí)際情況，則其測(cè)值更易受動(dòng)物的影響，變異就更大，因此也相應(yīng)更不精確”。
縱觀國(guó)內(nèi)外對(duì)于飼料能量生物學(xué)效價(jià)的種種評(píng)定方法，可以認(rèn)為在生物學(xué)效價(jià)的概念上，評(píng)定方法、手段的邏輯性上，理論與實(shí)踐的結(jié)合上都存在許多懸而未決的問題，應(yīng)該承認(rèn)當(dāng)前被長(zhǎng)期沿用的種種傳統(tǒng)生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方法大多是屬于約定俗成的權(quán)宜之計(jì)�；谝陨险J(rèn)識(shí)，本文對(duì)in vitro消化法方面的研究歷史進(jìn)行了簡(jiǎn)要回顧，大體上可分為“單一胃酶in vitro消化”階段、“胃-腸酶多步法in vitro消化”階段及作者等正在探索中的“電腦仿生程控三步消化法”三個(gè)歷史進(jìn)程。為了尋求便捷、實(shí)用、可信的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方法的科學(xué)技術(shù)路線，作者等曾對(duì)Furuya用“胃蛋白酶-豬小腸液”(PIF)的in vitro法測(cè)定消化能的方法及存在的問題進(jìn)行了驗(yàn)證，初步認(rèn)識(shí)到“以還原論為指導(dǎo)思想，將任何局部運(yùn)動(dòng)之和等同為整體的理念將很難解決傳統(tǒng)方法中存在的種種弊端”�；谝陨险J(rèn)識(shí)，作者等從單胃動(dòng)物豬、禽的仿生酶譜的建立，酶水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化乃至電腦程控消化系統(tǒng)中必須高度關(guān)注的關(guān)鍵性技術(shù)的全程仿生優(yōu)化組合技術(shù)路線及實(shí)施方案進(jìn)行了整體規(guī)劃。復(fù)雜問題的簡(jiǎn)單化必須從零開始，需要通過大量實(shí)踐檢驗(yàn)才有可能達(dá)到日趨客觀的現(xiàn)實(shí)�；谝陨险J(rèn)識(shí)，本文首先回顧了用in vitro酶水解法評(píng)定豬飼料消化能(DE)及氨基酸利用率(AAA)的簡(jiǎn)史，作者等基于用仿生消化電腦程控系統(tǒng)評(píng)定豬飼料EHGE的現(xiàn)狀及進(jìn)程，最后對(duì)用仿生酶消化電腦程控系統(tǒng)評(píng)定飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。希望能集思廣益，得到同行們的支持與批評(píng)指正。
1 國(guó)內(nèi)外用in vitro 消化法評(píng)定豬飼料消化能的研究進(jìn)展概況
由于動(dòng)物代謝試驗(yàn)法耗資、費(fèi)力、效率低，重演性、可比性差，同時(shí)測(cè)值又受到種種測(cè)試條件的限制，因此，自20世紀(jì)50年代以來，許多學(xué)者在通過in vitro法或insitu法，在探索模擬飼料養(yǎng)分在畜禽體內(nèi)的消化代謝規(guī)律的基礎(chǔ)上提出了種種簡(jiǎn)捷、易于執(zhí)行的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的評(píng)定方法，并在研究動(dòng)物消化酶的變異規(guī)律及其對(duì)不同養(yǎng)分的水解環(huán)境，從不同的角度進(jìn)行過大量工作。但從文獻(xiàn)報(bào)道的頻率和實(shí)際應(yīng)用方面則顯得不夠系統(tǒng)。總體來說是時(shí)起時(shí)落，尤其在in vitro消化法的研究方面，更顯得分散。粗略概括，大致是從早期的簡(jiǎn)單模擬胃酶消化過程到中期的模擬胃、腸道多步消化，最后向近期的全消化道仿生酶譜的建立到電腦仿生程控的方向發(fā)展。
1.1 簡(jiǎn)單胃酶消化法
最早Sheffner等用胃蛋白酶對(duì)飼料進(jìn)行了in vitro消化試驗(yàn)，并用以評(píng)定飼料或食物中蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值。該法見于AOAC等早期版本，作為測(cè)定動(dòng)物性蛋白質(zhì)飼料消化率的經(jīng)典方法沿用至今。我國(guó)也于1999年根據(jù)等同采用原則將該法列入飼料行業(yè)中的國(guó)家級(jí)推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T17811-1999，GB/T17811-2008)。此外，有關(guān)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶和凝乳酶等方面的報(bào)道不勝枚舉。胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，其他酶的含量較低，一般忽略不計(jì)。用胃蛋白酶水解法評(píng)定飼料或食物的可消化性，雖然只能反映在規(guī)范水解條件下對(duì)某一飼料或食物中的蛋白質(zhì)生物學(xué)效價(jià)的一個(gè)片面評(píng)價(jià)。由于這種方法便捷、重復(fù)性好、可比，而且醫(yī)藥用胃蛋白酶產(chǎn)品早已標(biāo)準(zhǔn)化，因此，仍然作為一種相對(duì)參比值被相關(guān)行業(yè)廣泛接受。
1.2 胃一腸酶多步水解法
鑒于用單一胃酶法評(píng)定飼料生物學(xué)效價(jià)的局限性。從20世紀(jì)70年代以后，許多學(xué)者在單一胃酶處理的基礎(chǔ)上用胰液、豬小腸液(porcine intestinal fluids，PIF)以及商品復(fù)合酶(如Viscozyme)乃至20%磺基水楊酸(PSA)等用于飼料有效能或蛋白質(zhì)氨基酸的“生物學(xué)效價(jià)”評(píng)定。
Goering和VanSoest最早用胃蛋白酶-豬小腸液(PIF)的in vitro消化方法，估測(cè)了飼料淀粉、粗蛋白的消化率和日糧纖維的降解率。這主要是基于日糧干物質(zhì)和粗蛋白的in vitro消化率測(cè)值與體內(nèi)消化率測(cè)值之間存在著較好的相關(guān)性。
Furuya等在系統(tǒng)研究了豬胃蛋白酶及PIF的最佳水解環(huán)境條件之后，提出了用胃蛋白酶及PIF凍干粉水溶液模擬胃腸兩步消化的in vitro法。Lowgren等在該法的基礎(chǔ)上，采用十二指腸液處理12h，再用回腸液和糞提取液處理48h，粗略評(píng)價(jià)了豬飼料樣品的in vitro干物質(zhì)消化率。
張子儀等(1982～1984)在前人工作的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)比較了從不同品種豬、飼喂不同類型日糧、不同瘺術(shù)部位采集的PIF酶活效價(jià)、鮮PIF與PIF凍干粉水溶液的酶活效價(jià)的差異，并在PIF凍干粉的保質(zhì)期、用PIF法測(cè)值的精度、重演性、可加性以及PIF法測(cè)值與全收糞法測(cè)值間的相關(guān)關(guān)系開展了必要的性能檢驗(yàn)。通過兩者之間的相關(guān)關(guān)系建立了以in vitro法為變量，以全收糞法為因變量，提出了豬飼料消化能值的回歸公式。經(jīng)過“七五”國(guó)家攻關(guān)全國(guó)協(xié)作及科研教學(xué)單位驗(yàn)證后，總結(jié)出了以胃蛋白酶和豬小腸液凍干粉水溶液處理為主要手段的in vitro消化試驗(yàn)方案。該法已被中國(guó)飼料工業(yè)協(xié)會(huì)、中國(guó)農(nóng)科院飼料所主編的《飼料生物學(xué)效價(jià)評(píng)定技術(shù)規(guī)程》所采納。由于該方案是手工操作，因此，受豬小腸液的采集、凍干粉的制備、貯存條件、水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化以及試劑盒的貯存條件、保質(zhì)期、售后服務(wù)以及測(cè)試者的素質(zhì)培訓(xùn)等客觀社會(huì)條件的限制，迄今該方法仍然難在生產(chǎn)上被廣大用戶接受。
此后，盧福莊等、杜榮等、李文英等還曾用PIF法與全收糞法的雞日糧代謝能值進(jìn)行了對(duì)比。在此前后，Drake曾用胃蛋白酶、胰酶連續(xù)透析法研究了畜禽對(duì)淀粉的消化率。Savoie和Gauthier、Derosicrs等曾用分子量為1000Da的透析袋在自制消化裝置中模擬了飼料蛋白質(zhì)的in vitro消化方法，研究了熱處理乳清蛋白中賴氨酸的破壞程度和食物中蛋白質(zhì)的in vitro消化率。
在這歷史時(shí)期，Dierick曾提出用胃蛋白酶制劑與胰酶制劑水解處理為標(biāo)志的in vitro兩步法。
在測(cè)定豬的能量消化率及蛋白質(zhì)、氨基酸利用率方面也取得了令人滿意的結(jié)果，但都限于所用酶制劑的標(biāo)準(zhǔn)化問題、以及試劑盒開發(fā)中的技術(shù)規(guī)范問題是否能達(dá)到腸道全程仿生效果，尚待進(jìn)一步研究。
進(jìn)入20世紀(jì)90年代，Bosien等、Boisen和Fernandez等、Bosien等前后報(bào)道了用胃蛋白酶-豬胰酶及Visozyme評(píng)定了飼料干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)和能量in vitro消化率，并與體內(nèi)法對(duì)比測(cè)定后，獲得令人滿意的結(jié)果。
加拿大學(xué)者Regmi等以三角瓶為反應(yīng)器，用胃蛋白酶-胰酶-“Viscozyme”①“PSA”②處理為主線的模擬胃腸水解環(huán)境及水解產(chǎn)物分離為目標(biāo)的in vitro法，提出了預(yù)測(cè)生長(zhǎng)豬對(duì)大麥樣本全消化道能量表觀消化率(apparent total tract digestibility，ATTD)的回歸模型(y=1.23x-25.33；R2=0.97)。
綜上所述，從仿生消化法研究的歷程分析，其初衷都是以便捷為前提，為獲取趨近于可信的生物學(xué)法信息為目標(biāo)，以精度、重演性好為約束條件。從上述單一胃消化法與胃腸酶消化多步法的設(shè)計(jì)原則分析，基本上如出一轍。從各家在選定的消化酶或商品消化酶產(chǎn)品的功能分析方面也都難免有以點(diǎn)代面，以面代全之嫌，在實(shí)際操作中又存在著酶譜設(shè)計(jì)、酶活力乃至酶與酶、外源酶與內(nèi)源酶之間互補(bǔ)頡頑，以及手工操作中不可回避的種種未知因素的干擾。因此，作者等認(rèn)為：沿用了近一個(gè)世紀(jì)的各種方案，都有必要互通有無(wú)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在模擬全消化道酶水解體系的仿生學(xué)方面作進(jìn)一步努力。
1.3 仿生酶消化法
進(jìn)入21世紀(jì)前后，許多學(xué)者又沿著胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme法的技術(shù)路線，在重演性方面進(jìn)行了類似研究。在Boisen等研究基礎(chǔ)上，Noblet等又用胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme系統(tǒng)分析了115種復(fù)合飼料和68種飼料成分�？隙嗽擉w系對(duì)生長(zhǎng)豬的飼料中有機(jī)物以及代謝能和凈能的生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方面具有可重復(fù)性。但是同時(shí)也指出該系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作過程相對(duì)復(fù)雜。Kim也指出在水解產(chǎn)物中油脂分離的重復(fù)性較差。
Boisen本人也指出該系統(tǒng)中在模擬消化液的制備、緩沖液的組成及水解時(shí)長(zhǎng)等方面存在著操作者之間的隨意性等遺留問題。
總體回顧，在諸多的國(guó)內(nèi)外研究者公開報(bào)道的酶消化體系的in vitro測(cè)試手段方面，基本上停留在以三角瓶、透析管、搖床等為組件的手工操作階段，人為設(shè)定酶譜條件下獲得的信息。無(wú)論從仿生的角度及從所獲參數(shù)的可比性與可重復(fù)性等方面都具有很大的局限性。為此，本研究組從20世紀(jì)后期開始，就仿生酶譜的設(shè)計(jì)定型依據(jù)，消化過程中水解環(huán)境、消化液的加入、乃至水解產(chǎn)物的分離，飼料樣品的制備、仿生酶消化系統(tǒng)、透析膜的篩選、飼料樣本量與消化酶的配套用量、緩沖液的配制(離子濃度、緩沖體系、pH等)、反應(yīng)溫度、消化時(shí)長(zhǎng)等因素的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范等方面的立論依據(jù)開展了研究，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了第一代到第三代“單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)”。
2 仿生酶消化法的發(fā)展目標(biāo)
回顧早期工作，基本是屬于探索到追蹤的過程。進(jìn)入21世紀(jì)，雖然在影響單胃動(dòng)物消化酶譜的因素及其發(fā)育變異規(guī)律方面進(jìn)行了必要研究，但仍屬初學(xué)階段，更復(fù)雜的問題乃至在傳統(tǒng)飼料養(yǎng)分的生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方面的難題還有待努力探索與深入研究。
基于“仿生”這主題本身就是一個(gè)永恒的課題，因此，因此作者等認(rèn)為：攻堅(jiān)的程序也只能以“已知”求“未知”。一蹴而就、一次到位是困難的，也是不可能的。
基于以上認(rèn)為：(1)為了能更趨近于動(dòng)態(tài)宿主主體在特定時(shí)間、空間條件下獲取飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的客觀信息，首先應(yīng)該在傳統(tǒng)飼料營(yíng)養(yǎng)評(píng)定工作的理論、涵義、評(píng)定手段等方面作整體反思，并能在被現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)與飼料工業(yè)所急需的便捷手段上尋求可行性技術(shù)路線。(2)在尚未能一次性獲得公允方案之前，所有創(chuàng)新方案應(yīng)具備以下條件：
①在規(guī)定試驗(yàn)研究條件下所獲得的信息或參數(shù)必須具有可信的精度和重演性，有利于對(duì)過去及未來的科研信息在同一條件下可比、可重演，以有利于用傳統(tǒng)法或種種倡議生成數(shù)據(jù)的吐故納新、淘而不汰；②飼料生物學(xué)效價(jià)評(píng)定項(xiàng)目名詞術(shù)語(yǔ)應(yīng)在相關(guān)信息管理系統(tǒng)的約束規(guī)定條件下標(biāo)準(zhǔn)化。繁簡(jiǎn)的度也應(yīng)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，作出適度的選擇(如DE-ME-NE-NEm)；③對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物特別是“荷術(shù)動(dòng)物”(hostal animal)應(yīng)在動(dòng)物福利(animal welfare)理念下更新觀念，提出試驗(yàn)動(dòng)物必須是在健康、舒適、無(wú)應(yīng)激的飼養(yǎng)環(huán)境下所獲得的信息；④不同種類、不同生長(zhǎng)階段的畜禽飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)仿生評(píng)定系統(tǒng)也應(yīng)擇重、漸進(jìn)、組織全國(guó)分期分批有計(jì)劃地協(xié)作完成。
3 結(jié)語(yǔ)
對(duì)傳統(tǒng)的以“套算法”為立論依據(jù)的豬單個(gè)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定體系，許多學(xué)者從組合效應(yīng)及邏輯學(xué)等角度提出質(zhì)疑。作者等認(rèn)為：鑒于豬是雜食動(dòng)物，從仿生學(xué)角度分析，其難度應(yīng)是介于反芻動(dòng)物與禽類之間的復(fù)雜問題。從國(guó)情考慮，還面對(duì)著以配合飼料為主的規(guī)�；B(yǎng)殖業(yè)體系與有啥喂啥的千家萬(wàn)戶養(yǎng)殖業(yè)體系。因此，在建立仿生酶消化法體系時(shí)，應(yīng)從我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的整體考慮，應(yīng)注意“粗飼料類型日糧”與“精飼料類型日糧”兩大飼料飼養(yǎng)體系的背景，審時(shí)度勢(shì)，擇重優(yōu)化技術(shù)路線。
在生物學(xué)效價(jià)的評(píng)定手段上，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家們?cè)谙�、代謝能和凈能的測(cè)試手段、立論依據(jù)、數(shù)學(xué)模型等方面進(jìn)行過大量的研究。最早可溯及法國(guó)化學(xué)家拉瓦錫(Lavaisier Antoine Laurent，1743～1794)創(chuàng)建的小型動(dòng)物呼吸代謝熱量測(cè)定裝置，他首次否定了“燃素說”，命名氧元素為“oxygen”，闡明了燃燒作用的氧化學(xué)說，再一次證實(shí)了“質(zhì)量守恒定律”。經(jīng)過近兩個(gè)多世紀(jì)的科研實(shí)踐，迄今消化能和代謝能測(cè)值仍然是“凈能體系”賴以成立的關(guān)鍵性決策依據(jù)。但是經(jīng)過實(shí)踐，許多學(xué)者從不同角度對(duì)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中的有效能值采用凈能體系提出質(zhì)疑，如Wiseman和Cole認(rèn)為凈能值太敏感不適宜實(shí)際應(yīng)用；美國(guó)NRC的專家們認(rèn)為凈能的測(cè)定太困難、不精確和受影響的因素太多；Emmans總結(jié)指出：能量用于維持和脂肪沉積、蛋白沉積的效率是不一樣的，因此不能用“凈能”來簡(jiǎn)單描述；Whittemore認(rèn)為凈能指標(biāo)并不比消化能、代謝能指標(biāo)為優(yōu)化飼料配方或預(yù)測(cè)生產(chǎn)成績(jī)提供更為精確的信息。因此，當(dāng)前對(duì)飼料能量生物學(xué)效價(jià)評(píng)定的一個(gè)共識(shí)仍然是像Fuller指出的那樣：“一個(gè)體系越是追求生產(chǎn)過程中的實(shí)際情況，則其測(cè)值更易受動(dòng)物的影響，變異就更大，因此也相應(yīng)更不精確”。
縱觀國(guó)內(nèi)外對(duì)于飼料能量生物學(xué)效價(jià)的種種評(píng)定方法，可以認(rèn)為在生物學(xué)效價(jià)的概念上，評(píng)定方法、手段的邏輯性上，理論與實(shí)踐的結(jié)合上都存在許多懸而未決的問題，應(yīng)該承認(rèn)當(dāng)前被長(zhǎng)期沿用的種種傳統(tǒng)生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方法大多是屬于約定俗成的權(quán)宜之計(jì)�；谝陨险J(rèn)識(shí)，本文對(duì)in vitro消化法方面的研究歷史進(jìn)行了簡(jiǎn)要回顧，大體上可分為“單一胃酶in vitro消化”階段、“胃-腸酶多步法in vitro消化”階段及作者等正在探索中的“電腦仿生程控三步消化法”三個(gè)歷史進(jìn)程。為了尋求便捷、實(shí)用、可信的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方法的科學(xué)技術(shù)路線，作者等曾對(duì)Furuya用“胃蛋白酶-豬小腸液”(PIF)的in vitro法測(cè)定消化能的方法及存在的問題進(jìn)行了驗(yàn)證，初步認(rèn)識(shí)到“以還原論為指導(dǎo)思想，將任何局部運(yùn)動(dòng)之和等同為整體的理念將很難解決傳統(tǒng)方法中存在的種種弊端”�；谝陨险J(rèn)識(shí)，作者等從單胃動(dòng)物豬、禽的仿生酶譜的建立，酶水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化乃至電腦程控消化系統(tǒng)中必須高度關(guān)注的關(guān)鍵性技術(shù)的全程仿生優(yōu)化組合技術(shù)路線及實(shí)施方案進(jìn)行了整體規(guī)劃。復(fù)雜問題的簡(jiǎn)單化必須從零開始，需要通過大量實(shí)踐檢驗(yàn)才有可能達(dá)到日趨客觀的現(xiàn)實(shí)�；谝陨险J(rèn)識(shí)，本文首先回顧了用in vitro酶水解法評(píng)定豬飼料消化能(DE)及氨基酸利用率(AAA)的簡(jiǎn)史，作者等基于用仿生消化電腦程控系統(tǒng)評(píng)定豬飼料EHGE的現(xiàn)狀及進(jìn)程，最后對(duì)用仿生酶消化電腦程控系統(tǒng)評(píng)定飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。希望能集思廣益，得到同行們的支持與批評(píng)指正。
1 國(guó)內(nèi)外用in vitro 消化法評(píng)定豬飼料消化能的研究進(jìn)展概況
由于動(dòng)物代謝試驗(yàn)法耗資、費(fèi)力、效率低，重演性、可比性差，同時(shí)測(cè)值又受到種種測(cè)試條件的限制，因此，自20世紀(jì)50年代以來，許多學(xué)者在通過in vitro法或insitu法，在探索模擬飼料養(yǎng)分在畜禽體內(nèi)的消化代謝規(guī)律的基礎(chǔ)上提出了種種簡(jiǎn)捷、易于執(zhí)行的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的評(píng)定方法，并在研究動(dòng)物消化酶的變異規(guī)律及其對(duì)不同養(yǎng)分的水解環(huán)境，從不同的角度進(jìn)行過大量工作。但從文獻(xiàn)報(bào)道的頻率和實(shí)際應(yīng)用方面則顯得不夠系統(tǒng)。總體來說是時(shí)起時(shí)落，尤其在in vitro消化法的研究方面，更顯得分散。粗略概括，大致是從早期的簡(jiǎn)單模擬胃酶消化過程到中期的模擬胃、腸道多步消化，最后向近期的全消化道仿生酶譜的建立到電腦仿生程控的方向發(fā)展。
1.1 簡(jiǎn)單胃酶消化法
最早Sheffner等用胃蛋白酶對(duì)飼料進(jìn)行了in vitro消化試驗(yàn)，并用以評(píng)定飼料或食物中蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值。該法見于AOAC等早期版本，作為測(cè)定動(dòng)物性蛋白質(zhì)飼料消化率的經(jīng)典方法沿用至今。我國(guó)也于1999年根據(jù)等同采用原則將該法列入飼料行業(yè)中的國(guó)家級(jí)推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T17811-1999，GB/T17811-2008)。此外，有關(guān)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶和凝乳酶等方面的報(bào)道不勝枚舉。胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，其他酶的含量較低，一般忽略不計(jì)。用胃蛋白酶水解法評(píng)定飼料或食物的可消化性，雖然只能反映在規(guī)范水解條件下對(duì)某一飼料或食物中的蛋白質(zhì)生物學(xué)效價(jià)的一個(gè)片面評(píng)價(jià)。由于這種方法便捷、重復(fù)性好、可比，而且醫(yī)藥用胃蛋白酶產(chǎn)品早已標(biāo)準(zhǔn)化，因此，仍然作為一種相對(duì)參比值被相關(guān)行業(yè)廣泛接受。
1.2 胃一腸酶多步水解法
鑒于用單一胃酶法評(píng)定飼料生物學(xué)效價(jià)的局限性。從20世紀(jì)70年代以后，許多學(xué)者在單一胃酶處理的基礎(chǔ)上用胰液、豬小腸液(porcine intestinal fluids，PIF)以及商品復(fù)合酶(如Viscozyme)乃至20%磺基水楊酸(PSA)等用于飼料有效能或蛋白質(zhì)氨基酸的“生物學(xué)效價(jià)”評(píng)定。
Goering和VanSoest最早用胃蛋白酶-豬小腸液(PIF)的in vitro消化方法，估測(cè)了飼料淀粉、粗蛋白的消化率和日糧纖維的降解率。這主要是基于日糧干物質(zhì)和粗蛋白的in vitro消化率測(cè)值與體內(nèi)消化率測(cè)值之間存在著較好的相關(guān)性。
Furuya等在系統(tǒng)研究了豬胃蛋白酶及PIF的最佳水解環(huán)境條件之后，提出了用胃蛋白酶及PIF凍干粉水溶液模擬胃腸兩步消化的in vitro法。Lowgren等在該法的基礎(chǔ)上，采用十二指腸液處理12h，再用回腸液和糞提取液處理48h，粗略評(píng)價(jià)了豬飼料樣品的in vitro干物質(zhì)消化率。
張子儀等(1982～1984)在前人工作的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)比較了從不同品種豬、飼喂不同類型日糧、不同瘺術(shù)部位采集的PIF酶活效價(jià)、鮮PIF與PIF凍干粉水溶液的酶活效價(jià)的差異，并在PIF凍干粉的保質(zhì)期、用PIF法測(cè)值的精度、重演性、可加性以及PIF法測(cè)值與全收糞法測(cè)值間的相關(guān)關(guān)系開展了必要的性能檢驗(yàn)。通過兩者之間的相關(guān)關(guān)系建立了以in vitro法為變量，以全收糞法為因變量，提出了豬飼料消化能值的回歸公式。經(jīng)過“七五”國(guó)家攻關(guān)全國(guó)協(xié)作及科研教學(xué)單位驗(yàn)證后，總結(jié)出了以胃蛋白酶和豬小腸液凍干粉水溶液處理為主要手段的in vitro消化試驗(yàn)方案。該法已被中國(guó)飼料工業(yè)協(xié)會(huì)、中國(guó)農(nóng)科院飼料所主編的《飼料生物學(xué)效價(jià)評(píng)定技術(shù)規(guī)程》所采納。由于該方案是手工操作，因此，受豬小腸液的采集、凍干粉的制備、貯存條件、水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化以及試劑盒的貯存條件、保質(zhì)期、售后服務(wù)以及測(cè)試者的素質(zhì)培訓(xùn)等客觀社會(huì)條件的限制，迄今該方法仍然難在生產(chǎn)上被廣大用戶接受。
此后，盧福莊等、杜榮等、李文英等還曾用PIF法與全收糞法的雞日糧代謝能值進(jìn)行了對(duì)比。在此前后，Drake曾用胃蛋白酶、胰酶連續(xù)透析法研究了畜禽對(duì)淀粉的消化率。Savoie和Gauthier、Derosicrs等曾用分子量為1000Da的透析袋在自制消化裝置中模擬了飼料蛋白質(zhì)的in vitro消化方法，研究了熱處理乳清蛋白中賴氨酸的破壞程度和食物中蛋白質(zhì)的in vitro消化率。
在這歷史時(shí)期，Dierick曾提出用胃蛋白酶制劑與胰酶制劑水解處理為標(biāo)志的in vitro兩步法。
在測(cè)定豬的能量消化率及蛋白質(zhì)、氨基酸利用率方面也取得了令人滿意的結(jié)果，但都限于所用酶制劑的標(biāo)準(zhǔn)化問題、以及試劑盒開發(fā)中的技術(shù)規(guī)范問題是否能達(dá)到腸道全程仿生效果，尚待進(jìn)一步研究。
進(jìn)入20世紀(jì)90年代，Bosien等、Boisen和Fernandez等、Bosien等前后報(bào)道了用胃蛋白酶-豬胰酶及Visozyme評(píng)定了飼料干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)和能量in vitro消化率，并與體內(nèi)法對(duì)比測(cè)定后，獲得令人滿意的結(jié)果。
加拿大學(xué)者Regmi等以三角瓶為反應(yīng)器，用胃蛋白酶-胰酶-“Viscozyme”①“PSA”②處理為主線的模擬胃腸水解環(huán)境及水解產(chǎn)物分離為目標(biāo)的in vitro法，提出了預(yù)測(cè)生長(zhǎng)豬對(duì)大麥樣本全消化道能量表觀消化率(apparent total tract digestibility，ATTD)的回歸模型(y=1.23x-25.33；R2=0.97)。
綜上所述，從仿生消化法研究的歷程分析，其初衷都是以便捷為前提，為獲取趨近于可信的生物學(xué)法信息為目標(biāo)，以精度、重演性好為約束條件。從上述單一胃消化法與胃腸酶消化多步法的設(shè)計(jì)原則分析，基本上如出一轍。從各家在選定的消化酶或商品消化酶產(chǎn)品的功能分析方面也都難免有以點(diǎn)代面，以面代全之嫌，在實(shí)際操作中又存在著酶譜設(shè)計(jì)、酶活力乃至酶與酶、外源酶與內(nèi)源酶之間互補(bǔ)頡頑，以及手工操作中不可回避的種種未知因素的干擾。因此，作者等認(rèn)為：沿用了近一個(gè)世紀(jì)的各種方案，都有必要互通有無(wú)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在模擬全消化道酶水解體系的仿生學(xué)方面作進(jìn)一步努力。
1.3 仿生酶消化法
進(jìn)入21世紀(jì)前后，許多學(xué)者又沿著胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme法的技術(shù)路線，在重演性方面進(jìn)行了類似研究。在Boisen等研究基礎(chǔ)上，Noblet等又用胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme系統(tǒng)分析了115種復(fù)合飼料和68種飼料成分�？隙嗽擉w系對(duì)生長(zhǎng)豬的飼料中有機(jī)物以及代謝能和凈能的生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方面具有可重復(fù)性。但是同時(shí)也指出該系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作過程相對(duì)復(fù)雜。Kim也指出在水解產(chǎn)物中油脂分離的重復(fù)性較差。
Boisen本人也指出該系統(tǒng)中在模擬消化液的制備、緩沖液的組成及水解時(shí)長(zhǎng)等方面存在著操作者之間的隨意性等遺留問題。
總體回顧，在諸多的國(guó)內(nèi)外研究者公開報(bào)道的酶消化體系的in vitro測(cè)試手段方面，基本上停留在以三角瓶、透析管、搖床等為組件的手工操作階段，人為設(shè)定酶譜條件下獲得的信息。無(wú)論從仿生的角度及從所獲參數(shù)的可比性與可重復(fù)性等方面都具有很大的局限性。為此，本研究組從20世紀(jì)后期開始，就仿生酶譜的設(shè)計(jì)定型依據(jù)，消化過程中水解環(huán)境、消化液的加入、乃至水解產(chǎn)物的分離，飼料樣品的制備、仿生酶消化系統(tǒng)、透析膜的篩選、飼料樣本量與消化酶的配套用量、緩沖液的配制(離子濃度、緩沖體系、pH等)、反應(yīng)溫度、消化時(shí)長(zhǎng)等因素的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范等方面的立論依據(jù)開展了研究，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了第一代到第三代“單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)”。
2 仿生酶消化法的發(fā)展目標(biāo)
回顧早期工作，基本是屬于探索到追蹤的過程。進(jìn)入21世紀(jì)，雖然在影響單胃動(dòng)物消化酶譜的因素及其發(fā)育變異規(guī)律方面進(jìn)行了必要研究，但仍屬初學(xué)階段，更復(fù)雜的問題乃至在傳統(tǒng)飼料養(yǎng)分的生物學(xué)效價(jià)評(píng)定方面的難題還有待努力探索與深入研究。
基于“仿生”這主題本身就是一個(gè)永恒的課題，因此，因此作者等認(rèn)為：攻堅(jiān)的程序也只能以“已知”求“未知”。一蹴而就、一次到位是困難的，也是不可能的。
基于以上認(rèn)為：(1)為了能更趨近于動(dòng)態(tài)宿主主體在特定時(shí)間、空間條件下獲取飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的客觀信息，首先應(yīng)該在傳統(tǒng)飼料營(yíng)養(yǎng)評(píng)定工作的理論、涵義、評(píng)定手段等方面作整體反思，并能在被現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)與飼料工業(yè)所急需的便捷手段上尋求可行性技術(shù)路線。(2)在尚未能一次性獲得公允方案之前，所有創(chuàng)新方案應(yīng)具備以下條件：
①在規(guī)定試驗(yàn)研究條件下所獲得的信息或參數(shù)必須具有可信的精度和重演性，有利于對(duì)過去及未來的科研信息在同一條件下可比、可重演，以有利于用傳統(tǒng)法或種種倡議生成數(shù)據(jù)的吐故納新、淘而不汰；②飼料生物學(xué)效價(jià)評(píng)定項(xiàng)目名詞術(shù)語(yǔ)應(yīng)在相關(guān)信息管理系統(tǒng)的約束規(guī)定條件下標(biāo)準(zhǔn)化。繁簡(jiǎn)的度也應(yīng)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，作出適度的選擇(如DE-ME-NE-NEm)；③對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物特別是“荷術(shù)動(dòng)物”(hostal animal)應(yīng)在動(dòng)物福利(animal welfare)理念下更新觀念，提出試驗(yàn)動(dòng)物必須是在健康、舒適、無(wú)應(yīng)激的飼養(yǎng)環(huán)境下所獲得的信息；④不同種類、不同生長(zhǎng)階段的畜禽飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)仿生評(píng)定系統(tǒng)也應(yīng)擇重、漸進(jìn)、組織全國(guó)分期分批有計(jì)劃地協(xié)作完成。
3 結(jié)語(yǔ)
對(duì)傳統(tǒng)的以“套算法”為立論依據(jù)的豬單個(gè)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定體系，許多學(xué)者從組合效應(yīng)及邏輯學(xué)等角度提出質(zhì)疑。作者等認(rèn)為：鑒于豬是雜食動(dòng)物，從仿生學(xué)角度分析，其難度應(yīng)是介于反芻動(dòng)物與禽類之間的復(fù)雜問題。從國(guó)情考慮，還面對(duì)著以配合飼料為主的規(guī)�；B(yǎng)殖業(yè)體系與有啥喂啥的千家萬(wàn)戶養(yǎng)殖業(yè)體系。因此，在建立仿生酶消化法體系時(shí)，應(yīng)從我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的整體考慮，應(yīng)注意“粗飼料類型日糧”與“精飼料類型日糧”兩大飼料飼養(yǎng)體系的背景，審時(shí)度勢(shì)，擇重優(yōu)化技術(shù)路線。
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