霉菌毒素常常發(fā)生在飼料和食品中，是由真菌產(chǎn)生的有毒、小分子次生代謝產(chǎn)物，包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧血腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素、伏馬毒素等，對人類和動物存在潛在的危害。
1 常用方法
　　 霉菌毒素的檢測方法很多，但由于霉菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性復(fù)雜，在樣品中分配不均和基質(zhì)的干擾，使其分析更加復(fù)雜。飼料的樣品基質(zhì)對霉菌毒素的影響最大，因為飼料是由多種物質(zhì)混合在一起的，不同的物質(zhì)中的霉菌毒素檢測的程序是不同的。通常，首先要對懷疑被污染的物質(zhì)進行嚴格的樣品處理，從樣品中提取毒素，分析之前再進行洗脫除去雜質(zhì)的干擾。在實際的分析中，有些方法可直接進行分離和定量，有些方法在分離和定量之前需要對霉菌毒素進行衍生。
　　有些霉菌毒素具有一個熒光特性的發(fā)色基團，如黃曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素(OT)、玉米赤霉烯酮(ZE)，樣品的提取物經(jīng)常用薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)來分離結(jié)構(gòu)相似的化合物和污染物。
　　通過比較樣品和標準品色譜的比移值(Rf)和保留時間來定性霉菌毒素，通過熒光強度和吸光度來定量霉菌毒素。一些霉菌毒素含有單端孢霉烯團，最大吸收值還不清楚，通常用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用色譜進行檢測。這些樣品在提取后，上樣之前通常需要進行柱前衍生。TLC和HPLC的方法對單端孢霉烯團有效，但對黃曲霉毒素的敏感性和特異性不強。TLC對谷物中的脫氧血腐鐮刀菌烯醇的檢測限是50～100μg/kg。
2 霉菌毒素分析的發(fā)展趨勢
2.1 提高采樣和質(zhì)量控制
　　霉菌毒素的分析步驟較多，每一步都有可能造成誤差，霉菌毒素分析的變異系數(shù)(CV)大于30%是很普遍的。因此，霉菌毒素分析技術(shù)的提高應(yīng)主要從以下幾方面入手：①簡化分析程序、盡可能縮短分析步驟；②減少基質(zhì)干擾，提高定量步驟的敏感性和特異性；③優(yōu)化樣品制樣，減少制樣誤差。美國規(guī)定了被黃曲霉毒污染的花生的制樣粒徑，歐洲幾國也作了規(guī)定，要求樣品制樣必須少量多樣。
　　美國的花生工業(yè)制定了一個連續(xù)的計劃，即通過降低不一致獲得相同的目標化合物。隨著更簡單、更精確、更昂貴的篩查和定量方法的發(fā)展，使用多樣品而不是一個量大的樣品來分析更加實際。樣品的轉(zhuǎn)運過程，尤其是在進入實驗室分析之前，應(yīng)避免在樣品收集過后產(chǎn)生霉菌毒素，造成制樣誤差。
　　提高質(zhì)量控制的另一個重要方面是使用質(zhì)控物質(zhì)。VanEgmond等人研究發(fā)現(xiàn)，檢測花生中的黃曲霉毒素時，分析產(chǎn)生的主要誤差來源于前處理時不完全提取和霉菌毒素的損失，當加入質(zhì)控物質(zhì)同時分析樣品時，分析方法準確度得到提高。Sharman等人在一個新方法評估中了使用質(zhì)控物質(zhì)，同時使用了免疫親和色譜和柱-高效液相色譜方法分析花生奶中的黃曲霉毒素，方法的準確度和精確度都得到了提高。
2.2 使用極性溶劑提取霉菌毒素和使用柱分離樣品
　　使用有機溶劑提取霉菌毒素的花費高，而且大家越來越認識到有機溶劑的毒性，開始使用毒性小、價格低的極性溶劑，如水和甲醇、水和乙腈。另外，可使用高容量，更加有效的填充小柱代替硅膠和硅酸鎂載體大柱，免疫親和色譜柱也可作為霉菌毒素的前處理工具。這些新方法不僅節(jié)約了有機溶劑和分析時間，而且更加有效。盡管新的樣品的提取方法有所發(fā)展，但對于一些新的檢測方法來說，如免疫測定方法和質(zhì)譜測定方法，這一步驟可完全省略。對一些液體樣品，如尿、牛奶等，提取、洗脫和濃縮可一步完成。
2.3 色譜技術(shù)的提高
　　雖然薄層色譜法沒有什么明顯的進步，但這一方法在霉菌毒素分析中被普通采用。預(yù)涂布(色譜)板是為高效薄層色譜法和反向薄層色譜法板商品化制造的，使用HPTLC板比傳統(tǒng)的薄層色譜板好，這是由于分析時可使用較少的溶劑。Bardburn等對谷物中黃曲霉毒素的幾個檢測方法進行比較研究，發(fā)現(xiàn)采用雙向HPTLC聯(lián)合苯基相方法凈化AF，回收率和精確度都提高。Bell等用HPLC、HPTLC、ELISA檢測花生醬中的AF，發(fā)現(xiàn)HPTLC比ELISA方法得到的數(shù)據(jù)更穩(wěn)定和變異系數(shù)更低。
　　HPLC方法在霉菌毒素(含有熒光和發(fā)色基團)檢測中的應(yīng)用始于19世紀70年代中期，使用化學(xué)吸收物質(zhì)有效地填充柱子，檢測器的效率、靈敏度和重現(xiàn)性均得到了較大提高。可見，HPLC檢測霉菌毒素是一種非常有效的方法。
　　使用極性溶劑作為萃取溶劑和簡化洗脫程序成了一種趨勢，在分析霉菌毒素如AF、OT、橘霉素、棒曲霉素、霉菌毒素的單端孢霉烯(TCTC)等時，使用反向的色譜柱也是一種趨勢。如AFB和AFG在經(jīng)過半縮醛衍生轉(zhuǎn)化后，熒光強度加強，AFB2a和AFG2a這兩個衍生物比AFB和AFG極性更高，更適合用反向色譜柱分離。因此HPLC是分析AF及其衍生物最常用、最有利的方法，即用反向C18柱進行分離，用熒光檢測器進行定量。因而，這個程序包括分離、定量和確證。1990年，HPLC檢測谷物和花生制品中的AF被美國官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會首次采用。
　　其他檢測方法，如常規(guī)相柱層析硅膠分離后AF用碘/溴柱后衍生，或者反相柱采用柱前衍生的方法，熒光強度也得到有效提高。OT和ZE用碘溶液柱前衍生沒有提高熒光強度。然而氨溶液作為柱前衍生試劑能加強OT的熒光強度。Francis等研究發(fā)現(xiàn)，在分析谷物中的AF時，β-環(huán)式糊精能加強其熒光強度。
　　除了AF和OT采用HPLC柱后或柱前衍生外，其他霉菌毒素如柄曲霉素、含有TCTC和煙色基團的霉菌毒素，沒有發(fā)色和熒光基團的，也采用該方法檢測。如煙曲霉毒素含有1個氨基基團和幾個羧酸基團，鄰苯二甲醛熒光試劑常用作衍生化試劑來增強其熒光強度。
　　隨著可見光-紫外多波長的發(fā)展，如光電二極管整列檢測器和多通道二極管整列檢測器，聯(lián)合計算機的搜索能力，可以實現(xiàn)色譜柱分離后對整個化合物的光譜圖進行監(jiān)測，結(jié)果得到了更進一步的確定。激光熒光法和同步熒光法在HPLC方法中也被使用起來提高檢測器的靈敏度。
　　大量的分析樣品需要檢測，就需自動化AF檢測方法的實驗步驟，在線分析、濃縮的自動化，免疫親和色譜柱作為凈化步驟，HPLC定量分析，使得HPLC分析霉菌毒素進入了一個新時代。
　　氣相色譜(GC)、毛細管超臨界流體色譜-負離子化學(xué)電離質(zhì)譜法也用來檢測霉菌毒素，對含有單端孢霉烯(TCTC)基團的霉菌毒素GC檢測方法仍然是最有效的。
2.4 質(zhì)譜方法的新發(fā)展
    在早期的調(diào)查中，質(zhì)譜沒有考慮作為霉菌毒素的定量方法。隨著質(zhì)譜的分辨率和計算機搜索能力的的提高，質(zhì)譜在霉菌毒素的定量和確定上得到了新發(fā)展。
2.4.1 高分辨率的質(zhì)譜
    高分辨質(zhì)譜化學(xué)電離方法常常產(chǎn)生1個正離子或1個負離子，強調(diào)產(chǎn)生1個分子離子作為黃曲霉毒素的分析。
    場解吸質(zhì)譜和快速原子轟擊和電力方法一起被應(yīng)用。
2.4.2 氣相色譜質(zhì)譜法
    隨著GC-MS的應(yīng)用，每個化合物可選用3個離子進行質(zhì)譜掃描。而且這種方法能檢測μg/mg級甚至更小的霉菌毒素，但還是存在相同的保留時間其他物質(zhì)的干擾。
2.4.3 串聯(lián)質(zhì)譜
    該方法目前已被廣泛使用。第一步是質(zhì)子分離，從基質(zhì)中選擇目標化合物，如分子離子、質(zhì)子化分子、分子負離子。第二步是用目標氣體如氬氣碰撞活化解離，母離子和子離子被用來分析。與選擇性模式相比，串聯(lián)質(zhì)譜的監(jiān)測系統(tǒng)叫多反應(yīng)監(jiān)測。
    Uyakual等使用GC串聯(lián)質(zhì)譜對AF進行了檢測。
2.4.4 液相色譜質(zhì)譜法
    隨著儀器的發(fā)展，可將質(zhì)譜和液相色譜聯(lián)合起來測定霉菌毒素，如高速原子沖擊法、熱噴霧、等離子體噴霧、動態(tài)的原子轟擊質(zhì)譜測定法，聯(lián)合LC已經(jīng)運用在多種霉菌毒素的分析上。
2.5 生物分析的提高
    霉菌毒素生物分析的進展也得到了提高，用來檢測鰓足蟲、老鼠纖維原細胞培養(yǎng)、幼鼠腎細胞中的含TCTC基團的霉菌毒素等。液式細胞計檢查在測定20份不同的霉菌毒素和毒性真菌提取物中小鼠骨髓瘤細胞NS-1的生存能力時是有效的。然而，大多數(shù)生物分析既不靈敏也不特效，僅僅用來作為掃描一般毒素的一種手段。
3 免疫化學(xué)發(fā)展的加強
    為了克服在化學(xué)和生物分析中遇到的困難，免疫化學(xué)方法得到了發(fā)展。因為霉菌毒素不是一種抗原，研究重點放在它們需要與蛋白質(zhì)和多肽鍵合在一起，在兔子和其他動物里產(chǎn)生多克隆抗體。隨著雜種瘤細胞技術(shù)的發(fā)展，針對多種霉菌毒素的單克隆抗體也制備出來。隨后，多種免疫分析方法，如放射性免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和其他幾種比較先進的免疫化學(xué)掃描方法也用于檢測霉菌毒素。這些方法都很靈敏、特效、操作簡單。特效抗體已經(jīng)被制備成免疫組織化學(xué)染色試劑并作為提取工具的免疫親和柱�？梢�，免疫分析在霉菌毒素分析中得到了廣泛運用。
    在討論不同類型的免疫分析過程之前，必須考慮以下幾個重要的標準：①因為大多數(shù)霉菌毒素的免疫分析存在著有毒樣品和無毒樣品鍵合競爭的問題。因此，對于抗體分子的特殊鍵合位點，除了在分析中有特殊的抗體外，還要有一個好的霉菌毒素標記；②對于精確定量，分離毒素的自由基和鍵合形式是很重要的；③抗體交叉反應(yīng)(特異性)和結(jié)構(gòu)類型變化較大，在分析中應(yīng)熟悉抗體的特異性；④樣品中結(jié)構(gòu)相似的化合物的存在，與抗體發(fā)生反應(yīng)是可能的。
    因此，在實驗前，應(yīng)該檢查基質(zhì)。以下描述的大多數(shù)免疫分析，樣品沒有凈化。樣品從固相基質(zhì)中提取后，用合適的緩沖溶液稀釋后，直接進行分析。然而，在適當?shù)牡南疵摵�，靈敏度有所提高。
3.1 放射免疫
    放射免疫程序是將特殊抗體、未知樣品溶液或已知標準品和一系列的標記毒物一起培育，在自由基和鍵合毒物分離后，測定片段中的放射強度，樣品中霉菌毒素的濃度通過和標準品比較而被確定。放射性標記物的特殊活性對實驗方法靈敏度非常重要。放射免疫方法能夠檢測到樣品的ng級甚至更低。放射性免疫法在提取或使用高活性的標記物后通過凈化能夠提高靈敏度。雖然放射性免疫檢測法檢測霉菌毒素能得到精確的數(shù)據(jù)，但因涉及放射性物質(zhì)的使用，主要用于研究性實驗。
3.2 競爭ELISA法
    有2種酶聯(lián)免疫測定法可用來檢測霉菌毒素即使用霉菌毒素—酶鍵合物的直接ELISA和使用霉菌毒素—蛋白質(zhì)鍵合物和鍵合了酶的鍵合物的間接ELISA，辣根過氧化酶、堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶常作為鍵合酶使用。
3.3 快速掃描檢測方法
    在間接和直接競爭ELISA方法中，通過縮短培養(yǎng)時間，調(diào)整酶和抗體的濃度，在一定濃度水平快速測定樣品，其原理和ELISA的原理相同。該方法反應(yīng)時間大大縮短，約需10～15min。
    Dewey等利用單克隆抗體建立了快速掃描方法檢測稻粒中的島青霉。另一種掃描方法是免疫親和方法，應(yīng)用于有熒光的霉菌毒素，如AF和OT的檢測。其過程是先用免疫親和柱洗脫，再用熒光檢測器檢測其濃度。
4 化學(xué)分析和免疫化學(xué)檢測方法互補
4.1免疫親和色譜為化學(xué)分析提供凈化工具
    1977年Sun等首次將免疫親和柱應(yīng)用于RIA檢測方法，后來用于測定尿和牛奶樣品中的AFM。該方法早期主要用于生物液體中，后來大量用于AF的檢測，包括固體樣品。大量研究表明該方法對AF的凈化非常有效。免疫親和柱和柱后衍生化試劑聯(lián)合應(yīng)用檢測日用品中的AF已經(jīng)成為官方方法。Carmen等采用自動控制的免疫親和柱凈化牛奶中AF并測定其含量。
4.2 免疫親和色譜
    ELISA作為HPLC的柱后監(jiān)測系統(tǒng)用于分析含TCTC基團的霉菌毒素。該類毒素首先被反向C18柱分離，分離出的霉菌毒素進行ELISA分析。這種方法不僅能確定含TCTC基團的霉菌毒素，而且能夠進行定量。低濃度的T-2毒素、相關(guān)的單端孢菌素及其代謝物也能通過這種方法檢測。已證明HPLC和ELISA聯(lián)合分析TCTC霉菌毒素是有效、靈敏、特異的。同樣，ELISA和TLC聯(lián)合也可用于分析霉菌毒素，即先通過TLC初步提取，然后用ELISA分析。