食品和飼料中動物源性成分檢測技術(shù)
2 基于DNA 序列特異性的鑒別技術(shù)
DNA分子是大多數(shù)生命體最核心的遺傳信息儲存單元，在細胞中大量存在，主要分布于細胞核和線粒體、葉綠體等一些細胞器中。與蛋白質(zhì)分子相比，DNA分子除了具有種內(nèi)保守性高，種間特異性強的優(yōu)點外還具有較高的熱穩(wěn)定性，而且其核苷酸序列不會受到環(huán)境和加工條件影響而改變，可獨立用于物種判別依據(jù)。因此，利用DNA分子序列特異性開發(fā)定性、定量檢測食品、飼料中動物源性成分的方法和技術(shù)定已成為該領(lǐng)域的研究焦點和主流，也是多數(shù)國家檢測方法標準中指定的檢測方法。
2.1 DNA 雜交技術(shù)
DNA雜交技術(shù)是PCR技術(shù)出現(xiàn)之前基于DNA序列特征識別動物源性鑒別技術(shù)的主要類別，其原理是根據(jù)堿基互補配對原理，利用標記有熒光素、生物素或放射性同位素等信號分子的特定DNA片段(探針)識別其互補序列DNA分子的技術(shù)，根據(jù)信號有無或強弱判斷樣品成分類別或多少。Ebbehoj和Thomsen等應(yīng)用32P-標記探針建立了檢測生、熟牛肉中豬肉成分的DNA雜交技術(shù)，同年開發(fā)了能夠區(qū)分近親物種成分(猴和人、牛和綿羊或山羊)的條形-斑點雜交技術(shù)，檢出限根據(jù)檢測對象親緣關(guān)系的遠近分布在0.01%～10%區(qū)間。隨后出現(xiàn)了大量類似的方法，可鑒別成分涵蓋了豬、牛、羊、雞、馬等主要動物種類。用于探針設(shè)計的靶序列通常為基因組DNA、衛(wèi)星DNA等，表2列出了相關(guān)研究的統(tǒng)計信息。
由于該方法沒有經(jīng)過PCR擴增靈敏度要低于PCR法，逐漸被PCR法替代，但近年來隨著芯片技術(shù)的發(fā)展DNA雜交結(jié)合PCR技術(shù)在高通量篩查技術(shù)中找到了新的舞臺。石豐運等建立了能同時檢測牛、山羊、豬、雞4種動物成分的基因芯片法，能實現(xiàn)一次反應(yīng)完成對多種動物源性成分的種類初篩和鑒定。深圳檢驗檢疫局開發(fā)了能同時檢測牛、羊、馬、豬、雞、鴨、鴿等16種動物源性成分的基因芯片技術(shù)，大大提高了篩查和成分鑒定效率。
2.2 基于PCR 的動物源性成分檢測技術(shù)
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)最早由Mullis等于1986年提出，理論上能夠?qū)悠分袉慰截惖腄NA片段進行指數(shù)倍擴增，將其應(yīng)用于動物源性成分檢測技術(shù)后，極大地提升了檢測靈敏度和結(jié)果可靠性。無論是普通PCR還是實時熒光PCR法，其核心內(nèi)容都是引物和探針的設(shè)計與制備，引物和探針體系的好壞決定了方法的優(yōu)劣。
線粒體DNA具有細胞內(nèi)拷貝量大、物種內(nèi)保守性高和物種間特異性強的優(yōu)點，常被用于擴增靶序列進行引物設(shè)計，如表3～6，細胞色素b(cytochromeb)、12SrRNA、ATP酶亞基6(mitochondrialATPasesub.6)、ATP酶亞基8(mitochondrialATPasesub.8)、細胞色素c氧化酶亞基1(COX1)等都有應(yīng)用。
2.2.1 PCR- 電泳
用物種間高異性引物對樣品中的DNA進行PCR擴增后瓊脂糖電泳分離，通過觀察是否有特異性條帶出現(xiàn)便可判定樣品中是否含有相應(yīng)的物種成分。該方法靈敏、便捷、準確，而且成本低廉，大量的具體方法和技術(shù)已被建立和開發(fā)，實現(xiàn)了對常見動物源性成分(單一或混合物)的快速檢測，詳見表3。該法只適合定性檢測，也可利用凝膠成像系統(tǒng)完成半定量分析，但無法實現(xiàn)樣品中特定成分含量的精確測定。
2.2.2 PCR-RFLP
限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)是應(yīng)用物種間同源基因上特定限制性內(nèi)切酶位點特異性來實現(xiàn)對樣品中動物源性成分來源的識別。此方法簡單高效，無需設(shè)計物種特異性引物，使用適合的通用引物即可，將擴增產(chǎn)物進行限制內(nèi)切酶反應(yīng)，通過分析電泳圖譜特征來判定物種來源，但該方法適合鑒別單一成分樣品，多物種混合物樣品由于電泳圖譜較為復雜，分析難度較高，結(jié)果可靠性較低。高琳等建立了以動物線粒體DNA中Cytb區(qū)段保守序列為靶序列的PCR-RFLP肉種檢測方法，能從豬、牛、羊、雞、鴨、兔6種生肉及高壓豬肉、豬肉火腿腸等7種熱加工肉制品中鑒別出豬源性和牛源性成分。Rea等同樣以Cytb為分析對象建立了能鑒別魚醬制品中歐洲鳀、黍鯡、沙丁魚單獨或混合DNA成分的PCR-RFLP法。Wang等進一步擴展了PCR-RFLP的應(yīng)用，將其和熒光標記技術(shù)結(jié)合建立了能夠檢測豬、牛、羊等12種肉種成分的T-RFLP技術(shù)，豐富了食品中DNA成分來源鑒定的篩查技術(shù)，該技術(shù)特點是將12SrRNA通用上游引物5＇端標記上FAM染料，下游通用引物5＇端標標記HEX染料，配合AluI和Tru9I兩種限制性內(nèi)切酶，通過熒光和條帶長度雙重信號判定結(jié)果，提高了RFLP法的靈敏度和準確性，并提供了快速鑒定食品中DNA成分來源的新途徑。表4列出了其他一些類似方法的統(tǒng)計信息。
2.2.3 PCR 測序
該方法是將特異性PCR反應(yīng)得到的擴增產(chǎn)物分離純化后進行測序，并到基因組數(shù)據(jù)庫進行序列比對來確定待檢樣品所屬的物種類型，例如，Iijima等建立了基于18SrRNA基因測序的食品中動植物源性成分來源分析方法，Girish等建立了基于線粒體12SrRNA基因測序的鑒定方法。我國國家標準“飼料中牛羊源性成分的定性PCR法(GB/T20190—2006《飼料中牛羊源性成分的定性檢測》)”也采用的是PCR測序方法(表6)。理論上該法準確、可靠，是理想的定性檢測方法，但須經(jīng)過分離、純化和測序的步驟，過程繁瑣限制了該方法的應(yīng)用，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展其價值也在逐步顯現(xiàn)。
2.2.4 隨機引物的擴增
隨機引物的擴增法(randomamplifiedpolymorphicDNA-PCR，RAPD)使用非特異性引物，能與模板上多個位點結(jié)合而不是與某一限制性位點特異性結(jié)合，經(jīng)過PCR擴增反應(yīng)后可產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物，最有效結(jié)合的引物在擴增過程中相互競爭而產(chǎn)生指紋，經(jīng)過凝膠電泳可產(chǎn)生物種特異性的圖譜，以此來鑒定樣品中的動物源性成。Saez等建立了能夠鑒別豬、牛、羊、雞和火雞的隨機引物擴增指紋圖譜技術(shù)，Cushwa等對RAPD在物種鑒定中的應(yīng)用做了詳細的綜述。RAPD的優(yōu)點在于無需知道分析對象的全基因組序列，但其局限性也很突出，如只適合分析單一成分樣品，而對分析多成分混合物會有一定困難。
2.2.5 實時熒光PCR
實時熒光PCR技術(shù)(real-timefluorescentpolymerasechainreaction，RT-PCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個反應(yīng)進程的PCR技術(shù)，并可通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術(shù)的出現(xiàn)使物種鑒別的靈敏性和準確性都有所提高，而且該技術(shù)無需進行電泳過程，避免了溴化乙錠等有毒染料的使用，降低了實驗對人體的危險系數(shù)。
其更大優(yōu)勢在于可通過設(shè)立外標物制作標準曲線實現(xiàn)對樣品中特定動物源性成分(DNA)含量的絕對定量，通過分別加入特異性引物和通用引物實現(xiàn)特定成分的相對定量，從而實現(xiàn)對肉類食品中摻假成分含量的測定和摻假行為嚴重程度的判定。其缺點是檢測成本較高，包括儀器和實驗耗材。
熒光監(jiān)測模式一般分為SYBRGreenI模式、水解探針模式、雜交探針模式3種，SYBRGreenI是一種只能與雙鏈DNA結(jié)合而無法與單鏈DNA結(jié)合的熒光燃料，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光增強1000倍，SYBRGreenI的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。Walker等開發(fā)了針對衛(wèi)星DNA和SINE特異性設(shè)計的能從未經(jīng)加熱處理的混合DNA樣品中定量檢出反芻動物、牛、豬和雞源性成分的SYBRGreenⅠ熒光定量檢測方法，F(xiàn)ajardo等隨后針對12SrRNA特異性開發(fā)了類似方法，詳見表5。SYBRGreenI模式的優(yōu)點是無需制備探針，成本低，通用性好。但該模式對PCR反應(yīng)中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，造成本體較高，假陽性結(jié)果產(chǎn)生幾率較大。為了解決此問題，張慧霞等嘗試用將溶解曲線分析引入到SYBRGreenⅠ實時熒光PCR檢測技術(shù)中，成功實現(xiàn)了混合物樣品中鵪鶉成分的檢出，在特異性和成本上找到了較好的平衡。
TaqMan探針法是水解探針模式的一種，引入了5＇端和3＇端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針，通過Taq酶5＇端外切酶活性釋放熒光信號，只有當樣品中含有擴增目的基因，并啟動擴增過程后熒光信號才會出現(xiàn)并逐漸積累，其信號強度與擴增出目的DNA片段有著緊密的正相關(guān)關(guān)系。與靶基因模板序列互補探針加強了信號特異性，使得TaqMan探針法在特異性上具有無以比擬的優(yōu)勢，是目前使用較多的方法類型。Rodríguez等建立起了混合肉樣中豬肉成定量檢測的TaqMan方法。
該方法基于線粒體12SrRNA基因序列設(shè)計了豬特異性引物和哺乳動物通用引物，兩套引物、探針位于相近位置，極大降低了由于擴增效率和加工過程中基因斷裂產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，但其擴增產(chǎn)物片段長度為425～428bp，不利于檢測熱加工后的樣品。Zhang等采用類似的設(shè)計理念，基于線粒體中細胞色素b，建立了能夠定量檢出鮮肉、熟肉制品、乳和乳酪中牛源性DNA的TaqMan方法，其擴增產(chǎn)物片段長度僅為133bp，能檢出35pg級的牛源性DNA，且無交叉反應(yīng)。
TaqMan探針法的缺點在檢測成本高和由于熒光淬滅不徹底導致的本底偏高，而新型的TaqMan探針——“MGB探針”有效解決了這一問題，使本底信號大大降低，Tanabe等據(jù)此建立了能夠檢出10ng/μL小麥線粒體DNA中100fg/μL的豬、雞、羊、馬肉DNA成分的方法，線性擬合度在0.994～0.999之間。
Abdulmawjood等將反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與MGB探針技術(shù)結(jié)合，建立了樣品中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)這一中樞神經(jīng)特異性標志物的mRNA的RT-PCR檢測法，實現(xiàn)了對樣品牛中樞神經(jīng)系統(tǒng)成分(CNS)的定向檢測，該方法具有很好的特異性，與心、肝、肺等非中樞神經(jīng)組織均無交叉反應(yīng)，檢出限為0.01%而且不會受到加熱工藝的影響。
雜交探針模式包括FRET雙雜交探針法、分子信標法等和屬于第3代熒光探針技術(shù)的Amplifluor法、LUX法等，也是適應(yīng)熒光PCR常見的技術(shù)類型，但在食品和飼料中動物源性DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域中還鮮有文獻報道。
實時熒光法的另一優(yōu)勢在于可通過標記不同的熒光基團(FAM、TET、VIC、HEX等)，實現(xiàn)多重PCR反應(yīng)多通道同步實時檢測，大大提高了檢測通量和效率。
雖然該技術(shù)試劑成本較高，不適于現(xiàn)場快速檢測，但由于其在靈敏度、準確性和重復性等重要性能參數(shù)上無可比擬的優(yōu)勢，仍是該領(lǐng)域的研究熱點和趨勢，是作為仲裁方法和司法鑒定的理想技術(shù)類型，是現(xiàn)行國家和行業(yè)標準中指定的方法之一。
2.3環(huán)介導等溫擴增技術(shù)
環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種嶄新的DNA擴增方法，與普通PCR相比其最大的特點是利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如BacillusstearothermophilusDNApolymerase)在65℃對樣品中DNA進行等溫擴增，而無需進行溫度變化循環(huán)，具有簡單、快速、特異性強的特點。Ahmed等開發(fā)出了基于環(huán)介導基因恒溫擴增(LAMP)和電化學芯片技術(shù)聯(lián)用的動物源性成分生物傳感鑒定技術(shù)(圖1)
，分別能檢出混合樣品中20.33ng/μL的豬肉成分，20.33ng/μL的雞肉成分，以及78.68pg/μL的牛肉成分。該技術(shù)為肉種鑒別技術(shù)小型化、便攜化合自動化開辟了新的途徑。LAMP法也有局限性，由于是鏈置換合成，不適合進行長鏈DNA的擴增，在產(chǎn)物回收鑒定、克隆、單鏈分離方面的表現(xiàn)也不如傳統(tǒng)PCR。準，由于動物DNA組的復雜性，單純PCR產(chǎn)物分析較容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此為了提高檢測結(jié)果的準確性，標準中指定的方法通常在特異性PCR擴增結(jié)果后加上限制性內(nèi)切酶驗證或測序的步驟。由于TaqMan實時熒光PCR法中引入了特異性的探針分子大大增強了信號的特異性和結(jié)果準準確性。上述兩種方法是我國現(xiàn)行標準的指定鑒定方法，詳見表6。
但目前所指定的方法都是定性檢測方法，還未涉及定量檢測方法，定量檢測方法還待進一步研究和建立。
