番茄(Solanum lycopersicum)是一種世界性蔬菜,在蔬菜生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位, 也是基礎(chǔ)生物學研究中的重要對象和模式植物, 在所有蔬菜作物中番茄的研究文獻居于首位。由于番茄研究深入,而且易于轉(zhuǎn)化, 轉(zhuǎn)基因番茄研究與應用得到了迅速的發(fā)展。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟與發(fā)展, 越來越多的轉(zhuǎn)基因番茄已被研制成功, 并逐步走向產(chǎn)業(yè)化階段。本文就目前轉(zhuǎn)基因番茄的研究以及產(chǎn)業(yè)化情況進行概述, 為進一步進行轉(zhuǎn)基因番茄研究工作提供重要的基礎(chǔ)信息, 同時也為進行轉(zhuǎn)基因番茄的管理和研究提供理論基礎(chǔ)。
1 轉(zhuǎn)基因番茄的研究現(xiàn)狀
    目前, 在抗病蟲害、抗除草劑、抗逆、延遲成熟、雄性不育等方面已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株, 同時利用番茄作為植物反應器生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白的基因工程研究也取得了長足的進展。
1.1 抗病轉(zhuǎn)基因番茄
    抗病育種一直是育種工作者的主要育種目標,轉(zhuǎn)基因番茄可以彌補常規(guī)抗病育種工作的不足, 從而獲得常規(guī)育種不能獲得或很難獲得的抗病番茄種質(zhì)資源, 因此引起了科研人員的極大興趣。目前抗病的轉(zhuǎn)基因番茄主要包括抗病毒、抗真菌及抗細菌病害等3 個方面的研究內(nèi)容。
1.1.1 抗病毒轉(zhuǎn)基因番茄
    煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、苜�；ㄈ~病毒(AMV)和番茄黃花卷葉病毒(TYLCV)等是引起番茄病毒病的主要病原。在番茄轉(zhuǎn)基因抗病毒育種中, 主要利用病毒的外殼蛋白(Coat protein,CP)基因、復制相關(guān)蛋白(Replication-associated protein,REP)基因、衛(wèi)星RNA 基因和病毒片段的反義RNA 基因等。外殼蛋白(CP)在轉(zhuǎn)基因植物中的積累可以干擾病毒脫衣殼, 抑制病毒在植物體中的復制、轉(zhuǎn)運和積累從而使轉(zhuǎn)基因植株獲得了病毒抗性。1986 年, Powell 等首次將煙草花葉病毒外殼蛋白基因(TMV-CP)轉(zhuǎn)入番茄, 這是第一例有成功報道的轉(zhuǎn)基因番茄。我國首例批準商品化的抗病毒的轉(zhuǎn)基因番茄也是利用CP 蛋白實現(xiàn)的, 此后, CP 蛋白和REP 蛋白多次用于番茄的抗病毒基因工程中。利用反義RNA 技術(shù), 通過設(shè)計病毒復制原點區(qū)域序列的反義RNA 或反轉(zhuǎn)錄病毒模板的反義RNA, 最終阻斷病毒的增殖, 達到抑制病毒的作用也是番茄抗病毒研究的一個策略。朱秋菊利用反義RNA 技術(shù),構(gòu)建了反義CMV-CP 的植物表達載體, 進行番茄轉(zhuǎn)基因研究, 得到具有CMV 抗性的轉(zhuǎn)基因植株。RNA干擾(RNAi)技術(shù)在番茄的抗病毒研究中也起到了重要作用, Tamarzizth 等利用RNAi 技術(shù)將TYLCV 病毒的截短型復制相關(guān)蛋白基因正義/反義構(gòu)建到RNAi 表達載體上進行番茄轉(zhuǎn)化, 轉(zhuǎn)基因植物可抑制TYLCV 的復制, 得到高抗TYLCV 感染的轉(zhuǎn)基因植株。MicroRNA 具有重要的調(diào)節(jié)功能, 包括生長發(fā)育、形態(tài)建成、逆境應答、激素反應和病毒誘導等,因此microRNA 基因的挖掘與利用是這幾年的研究熱點。Zhang 等構(gòu)建了兩個含有2a、2b 基因和病毒CMV 的3′UTR 的microRNA 載體并進行了番茄轉(zhuǎn)化, 轉(zhuǎn)基因后代對CMV、TMV 及TYLCV 產(chǎn)生了抗性。
1.1.2 抗真菌病害轉(zhuǎn)基因番茄
    能引起番茄真菌病害的病原菌種類多、范圍廣,受到廣大育種工作者的重視。在番茄的抗真菌病害基因工程中, 目前研究較多的是幾丁質(zhì)酶基因、葡聚糖酶基因、番茄自身的抗病基因、植保素基因等。幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶可以降解病原菌的細胞壁, 從而破壞病原菌, 降低真菌的侵染性。1995 年,Jongedijk 等將煙草I 型幾丁質(zhì)酶和β-1,3 葡聚糖酶轉(zhuǎn)入番茄中, 成功表達這兩種酶的轉(zhuǎn)基因番茄植株在接種枯萎病鐮刀菌(Fusarium Oxyspersici f.sp. lycopersici)后表現(xiàn)出一定抗性。Chen 等將水稻的幾丁質(zhì)酶基因和苜蓿的防御素基因同時轉(zhuǎn)化到番茄中,經(jīng)接種灰霉病病原菌Botrytis cinerea 鑒定, 同時含這兩種基因的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對灰霉病的高抗性。植物的植保素和抗菌蛋白在植物受到病原菌侵染時可以調(diào)動自身的防御反應, 加強抗病性。Thomzik 等將葡萄的Vst1 和Vst2 兩個基因(植保素合成的前導基因)轉(zhuǎn)入到番茄中后, 轉(zhuǎn)基因番茄植株可產(chǎn)生反式白梨蘆醇(植保素的一種), 使番茄植株表現(xiàn)出對番茄晚疫病的高抗病性。多年來, 大量的研究使轉(zhuǎn)基因抗真菌病害取得了長足的進展, 但同時抗多種病害的轉(zhuǎn)基因番茄還鮮有報道。Khan 等將山崳菜的芥末防衛(wèi)素基因(WD)利用多元自主轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入到番茄中, 轉(zhuǎn)基因植株對B.cinerea (灰霉病病原菌)、Alternaria solani (早疫病病原菌)、F. oxysporum (枯萎病病原菌) 和 Erysiphelycopersici (白粉病病原菌)均產(chǎn)生抗性。
1.1.3 抗細菌病害轉(zhuǎn)基因番茄
    番茄的細菌病害主要有細菌性斑點病、青枯病及潰瘍病等。Tai 等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將來源于辣椒的Bs2 基因(細菌性斑點病抗性基因)轉(zhuǎn)入番茄中, 獲得的轉(zhuǎn)基因植物對由黃單孢菌(Xanthormonas campestris)引起的細菌性斑點病的抗病性明顯提高。轉(zhuǎn)化學合成的巨大蠶蛾的陽離子溶菌肽B 的番茄植株, 接種細菌性青枯病(Ralstonia solanacearum)和細菌性斑點病(X. campestris pv. vesicatoria)病原菌后, 轉(zhuǎn)基因植株對兩種病害均表現(xiàn)出高抗病性。乙烯在番茄植株抗?jié)�瘍�?Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)中起到重要作用, Balaji 等將細菌ACC 脫氨酶基因ACD(Bacteriac ACC deaminase)轉(zhuǎn)入到番茄中, ACD 基因超量表達阻礙了乙烯的合成,轉(zhuǎn)基因植株中潰瘍病的病癥發(fā)生推遲。
1.2 抗蟲轉(zhuǎn)基因番茄
    在抗蟲轉(zhuǎn)基因番茄研究方面, 主要應用的是來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiens)的Bt 基因。1987 年, Fischhoff 等首次用Ti 質(zhì)粒將Bt 毒素蛋白基因CryIA(b)轉(zhuǎn)入番茄, 在CaMV 35s 啟動子的控制下, 轉(zhuǎn)基因植株大大地提高了對煙草天蛾的抗性能力, 同時轉(zhuǎn)CrylA(b)和CrylC 基因的番茄植株可對甜菜夜蛾、煙草夜蛾產(chǎn)生抗性。植物中的抗性基因也有應用報道, 如利用雪花蓮外源凝集素基因(GNA)產(chǎn)生抗蚜蟲的轉(zhuǎn)基因番茄, 利用白楊的幾丁質(zhì)酶基因(WIN6)可降低馬鈴薯甲蟲對轉(zhuǎn)基因番茄的侵染。此外, Chen 等將從普通番茄抗根結(jié)線蟲品系中克隆得到的根結(jié)線蟲抗性基因(Mi 基因)轉(zhuǎn)入到易感番茄品系中, 轉(zhuǎn)化植株的抗根結(jié)線蟲能力顯著提高。2010 年, Chan 等將芋頭的半胱氨酸蛋白酶抑制劑CeCP1 基因轉(zhuǎn)入到番茄中, 獲得了對根結(jié)線蟲的侵染和繁殖均有抑制作用的轉(zhuǎn)基因番茄。
1.3 抗逆轉(zhuǎn)基因番茄
    國內(nèi)外對番茄抗逆的轉(zhuǎn)基因研究主要集中在耐鹽、耐寒、耐旱、耐熱等方面, 其中耐鹽、耐寒的研究尤為深入。自1991 年Hightower 等將比目魚體內(nèi)的抗凍蛋白(AFP)基因轉(zhuǎn)入番茄、1997年黃永芬等將美洲擬蝶魚的AFP 基因?qū)�入番茄獲得了抗冷性提高的轉(zhuǎn)基因番茄植株, 拉開了抗冷轉(zhuǎn)基因番茄的帷幕。隨后, 趙春梅等將由CaMV 35S啟動子驅(qū)動的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小分子熱激蛋白(ER2sHSP)基因?qū)�入番�? 在冷脅迫下, 轉(zhuǎn)基因番茄的冷害癥狀減輕, 葉綠素含量損失少, 體內(nèi)積累的丙二醛(MDA)含量少, 電解質(zhì)外滲程度低, 具有較高的凈光合速率和最大光化學效率, 具有較強的冷脅迫耐性。Singh 等采用Rd29A 啟動子, 將At-CBF1 轉(zhuǎn)化到番茄中, 轉(zhuǎn)基因T1 代植株在形態(tài)學和農(nóng)藝學性狀上與非轉(zhuǎn)基因植株無差別, 但耐冷性提高了40%(4℃處理3 d), 轉(zhuǎn)基因植株SOD、NPQ 增高, MDA 含量降低。此外, 番茄耐熱及耐旱基因工程也進行了大量研究。將擬南芥C 重復/脫氫反應結(jié)合因子1(CBF1)基因轉(zhuǎn)入番茄, 在逆境條件下, 可提高植株對冷害、干旱及鹽脅迫的適應 。Cheng 等 將酵母SAMDC(S-adenosyl-I-methionine decarboxylase, S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶)基因通過葉盤法轉(zhuǎn)入到番茄中,轉(zhuǎn)基因植株可經(jīng)受38℃高溫。Pan 等研究表明, 在番茄中表達缺失EAR域的ERF II 型蛋白可提高植株的整體抗逆性。Li 等將草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的細胞凋亡抑制基因SflAP 轉(zhuǎn)入到番茄后,轉(zhuǎn)基因番茄對熱脅迫、鹽脅迫、付馬菌素(FB1)及早疫(Alternaria alternata)病抗性均比對照提高。microRNA 在番茄的抗逆中也有應用, SlymiR169c負調(diào)控番茄干旱反應的氣孔運動, 過量表達Sly-miR169c 可以降低氣孔打開、減少蒸騰速率、降低葉片失水度、提高抗旱性, 而轉(zhuǎn)ath-miR399d番茄可以增加根部對P 的吸收。
1.4 抗除草劑轉(zhuǎn)基因番茄
    作物中除草劑的解毒或降解主要利用來源于植物或微生物的解毒酶的作用, 主要包括：(1)針對莠去津的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶; (2)針對溴草腈的腈水解酶(由bxn 基因編碼); (3)針對草丁膦的草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT(由Bar 基因編碼); (4)針對有機磷農(nóng)藥的水解酶OPH(Organophosphorushydrolase)的編碼基因opd (Organophosphorus pesticidedegrading)。轉(zhuǎn)基因番茄的抗除草劑性能主要通過修飾或過量表達除草劑作用的靶蛋白或轉(zhuǎn)入解毒酶的手段來實現(xiàn)。Bar 基因可乙�；�草丁膦的自由氨基使草丁膦失去作物毒性; EPSP 合成酶(5-enolppyruvylshikimate-3-phosphate synthetase)是草甘膦作用的靶標, 通過EPSP 合成酶突變基因, 可以使作物對草甘膦的親和力下降, 從而得到抗草甘膦植株。現(xiàn)已獲得抗草丁膦的轉(zhuǎn)Bar 基因番茄和抗草甘膦的轉(zhuǎn)突變的EPSP 合成酶基因番茄等。此外, 利用opd 基因得到的轉(zhuǎn)基因番茄具有水解有機磷農(nóng)藥蠅毒磷的活性, 最大酶活約11.59 U/mg 可溶性蛋白。
1.5 耐貯及延熟的轉(zhuǎn)基因番茄
    耐貯及延熟的轉(zhuǎn)基因番茄主要通過抑制細胞壁降解或抑制乙烯合成來實現(xiàn)。乙烯的最初前體是甲硫氨酸, 首先甲硫氨酸經(jīng)腺苷甲硫氨酸水解酶(S-adenosylmethionine hydrolase, SAMase)作用合成SAM (S-腺苷-L-甲硫氨酸), SAM 在ACC 合成酶的作用下合成ACC, 然后ACC 在ACC 氧化酶(EFE)的作用下分解出乙烯, 而這兩種酶被大的基因家族所編碼。如果在植物體內(nèi)表達ACC 合成酶或ACC氧化酶的反義RNA, 就會延遲成熟。我國第一個商品化的轉(zhuǎn)基因番茄就是通過轉(zhuǎn)反義的EFE 基因?qū)崿F(xiàn)的, Kramer 等也利用編碼SAMase 的基因獲得了轉(zhuǎn)基因成熟延遲的番茄植株。另外, 細胞壁水解酶與果實的成熟也有密切關(guān)系, 世界上首例商品化的轉(zhuǎn)基因番茄Flavr SavrTM 是通過轉(zhuǎn)反義的多聚半乳糖醛酸酶PG 基因, 使細胞壁的果膠降解而得到的耐貯番茄的例子, 轉(zhuǎn)反義PG 基因降低了轉(zhuǎn)基因番茄的PG 酶活性, 改良了果實風味、顏色及甜度, 最重要的是延長了果實的貨架壽命。隨后, Wang 等將脫氧輔蛋白酶(Deoxyhypusinesynthase)基因分別轉(zhuǎn)入番茄, 也獲得延遲成熟的番茄植株。
1.6 品質(zhì)及風味改良的轉(zhuǎn)基因番茄
    目前改良番茄品質(zhì)的研究主要有增加番茄甜度、提高番茄可溶性固形物和番茄紅素含量(表3)。Bartoszewski 等將非洲竹芋(Thaumatococcusdaniellii Benth)中的奇異果甜蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄中,經(jīng)感官測試, 轉(zhuǎn)基因番茄的甜度顯著高于對照。Neily 等 將蘋果中的亞精胺合成酶基因(Md-SPDS1)轉(zhuǎn)入到番茄中, 番茄紅素的合成酶酶系表達量升高, 降解酶酶系表達量下降, 使轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素量增加。Carmi 等在番茄子房中特異表達發(fā)根農(nóng)桿菌rolB 基因, 得到單性結(jié)實番茄, 轉(zhuǎn)rolB 基因的植株具有植物生長素的特性, 該轉(zhuǎn)基因番茄在早產(chǎn)性、豐產(chǎn)性及可溶性固形物均有所提高。風味也是影響番茄銷量的重要品質(zhì), 1996 年, Wang等在番茄中表達了酵母D-9 脫飽和酶基因, 使番茄中影響風味的化合物順式-3-乙烯醇、1-己醇、乙醛和順式-3-乙烯醛含量發(fā)生變化。Davidovich-Rikanati等將羅勒(Ocimum basilicum)中的香葉醇合酶基因在番茄中表達, 改善了番茄的口感和芳香味。
1.7 雄性不育的轉(zhuǎn)基因番茄
    對于自花授粉作物, 利用雄性不育系制種可以簡化育種步驟, 省時省力, 而且能提高制種質(zhì)量。因此, 自Mariani 等利用花粉絨氈層特異啟動子啟動核糖核酸酶基因在番茄中表達, 引起花粉敗育,得到雄性不育的轉(zhuǎn)基因番茄后, 利用雄性不育系的轉(zhuǎn)基因番茄研究也有一些文獻報道。Sandhu 等利用RNAi 技術(shù)將核基因Msh1 的表達抑制后, 使線粒體DNA 重排, 得到細胞質(zhì)雄性不育植株; 宋洪元等利用Cre/lox 重組技術(shù), 得到了雄性不育恢復系的番茄基因工程植株, 這些都推動了番茄雄性不育基因工程研究, 為雄性不育制種的利用及簡化雜交制種技術(shù)提供了材料基礎(chǔ)。
1.8 表達醫(yī)藥蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄
    利用番茄作為生物反應器生產(chǎn)疫苗、醫(yī)藥蛋白等研究正成為番茄基因工程研究的一個熱點。目前主要用番茄作為生物反應器生產(chǎn)抗原, 從而使人體獲得抗體, 另外就是直接生產(chǎn)有功能的醫(yī)藥蛋白。在抗原方面, 主要獲得了含狂犬病病毒G 蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄、含有乙型肝炎病毒表面抗原基因(HBsAg)的轉(zhuǎn)基因番茄、含有呼吸道合包體病毒(RSV)F 蛋白基因的轉(zhuǎn)基因番茄、含Norwalk 病毒衣殼蛋白轉(zhuǎn)基因番茄、可產(chǎn)生SARS 冠狀病毒(SARS-CoV)S 蛋白特異抗體IgA 的轉(zhuǎn)基因番茄及可產(chǎn)生抗霍亂疫苗的番茄等。在功能蛋白方面,Mor 等將人乙酰膽堿酯酶轉(zhuǎn)入到番茄中, 轉(zhuǎn)基因番茄果實中可檢測到高量表達的乙酰膽堿酯酶活性,可用來預防和治療有機磷引起的中毒。陳溪等利用植物偏愛密碼子人工合成了人胰島素基因, 轉(zhuǎn)化番茄后, 為口服方式攝入胰島素達到預防I 型糖尿病的成功奠定了基礎(chǔ)。此外, 小鼠的白細胞介素IL-12 蛋白、人凝血IX 因子蛋白、α-1-抗胰蛋白酶蛋白等都在番茄中得到了成功表達。

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